Štúdia: Hliník v bunkovom tkanive mozgov autistov

24.12.2017 12:51

Journal of Trace Elements in Medicine and Biologyzväzok 46, III.2018, strany 76–82

Matthew Mold,[a] Dorcas Umar,[b] Andrew King,[c] Christopher Exley[a]

 

PDF verzia slovenského prekladu tejto štúdie    Pôvodnú štúdiu Aluminium in brain tissue in autism
    z angličtiny preložil Ing. Marián Fillo.

 

Súhrn

    Porucha autistického spektra (angl. Autism Spectrum Disorder = ASD) je neurovývinová poru­cha neznámej etiológie (nie je známe, ako vzniká a čo ju zapríčiňuje). Uvažuje sa, že by mohlo ísť ako o dedičnú (genetickú) náchylnosť, tak aj o a činitele životného prostredia (environmentálne fak­tory), vrátane jedov (toxínov) zo životného prostredia. Vystavenie človeka hliníku bolo spojené, pri­najmenšom pokusne, s ASD. V tejto štúdii sme ako prví použili atómovú absorpčnú spektrometriu pomocou priečne vyhrievanej grafitovej piecky na meranie obsahu hliníka v mozgovom bunkovom tkanive darcov s diagnózou autizmus. Použili sme tiež na hliník sa viažuci fluór na zistenie hliníka v mozgu pomocou fluorescenčnej mikroskopie. Obsah hliníka v mozgovom tkanive autistov bol konzistentne vysoký. Priemery (štandardné odchýlky) obsahu hliníka u všetkých 5 jedincov boli pre jednotlivé skúmané laloky (tylový, čelný, spánkový, temenný): 3,82 (5,42), 2,30 (2,00), 2,79 (4,05) a 3,82 (5,17) μg/g suchej hmotnosti. To sú tie najvyššie hodnoty obsahu hliníka v ľudskom mozgu, aké boli doposiaľ zaznamenané, a človek by sa mal opýtať napr.: Prečo by mal byť obsah hliníka v tylovom laloku 15-ročného chlapca 8,74 (11,59) μg/g suchej hmotnosti?

    Hliník zvýrazňujúca fluorescenčná mikroskopia bola použitá na zistenie hliníka v mozgovom tkanive 10 darcov. Zatiaľčo bol hliník zobrazený v spojení s neurónmi, ukázal sa byť prítomný vnú­tri mikrogliám podobných buniek a ďalších zápalových ne-neurónových buniek v mozgových bla­nách (meningoch), cievach, šedej a bielej hmote. Prevaha vnútrobunkového hliníka v ne-neuróno­vých bunkách v bunkových tkanivách v mozgoch autistov je prelomovým objavom, ktorý môže byť vodidlom k zisteniu jednak pôvodu hliníka v mozgu, jednak jeho predpokladanej úlohy v ASD.

 

Kľúčové slová

Vystavenie človeka hliníku, bunkové tkanivo ľudského mozgu, porucha autistického spektra, prieč­ne vyhrievaná atómová absorpčná spektrometria, hliník zvýrazňujúca fluorescenčná mikroskopia

 

1. Úvod

    Porucha autistického spektra (ASD) je skupinou neurovývinových chorôb s neznámou príčinou. Je vysoko pravdepodobné, že s nástupom a stupňovaním sa ASD sú spojené ako dedičnosť[1], tak aj činitele životného prostredia,[2] zatiaľčo sa očakáva, že mechanizmy vzniku ASD sa skladajú z nie­koľkých činiteľov.[3][4][5][6] Vystavenie človeka hliníku bolo zapletené do ASD, avšak závery boli nejed­noznačné.[7][8][9][10] Väčšina dodnes vykonaných štúdií používala vlasy ako známku vystavenia človeka hliníku, aj keď hliník v krvi a moči bol tiež používaný, ale v oveľa menšej miere. Detské vakcíny, obsahujúce hliníkový adjuvant, sú nepriamou mierou vystavenia dojčaťa hliníku a ich čoraz väčšie používanie priamo koreluje s nárastom výskytu ASD.[11] Zvieracie modely ASD naďalej podporujú spojitosť s hliníkom a hliníkovými adjuvantmi, používanými obzvlášť vo vakcínach pre ľudí.[12] Do­posiaľ neboli zverejnené žiadne správy o hliníku v bunkovom tkanive mozgov od darcov, ktorí zo­mreli s diagnózou ASD. My sme merali obsah hliníka v bunkovom tkanive mozgov autistov a zistili sme umiestnenie hliníka v týchto tkanivách.

 

2. Materiály a metódy

2.1. Meranie obsahu hliníka v bunkových tkanivách mozgu

    Etické povolenie sme dostali spolu s bunkovými tkanivami z Oxfordskej mozgovej banky (Ox­ford Brain Bank): č. 15/SC/0639. Vzorky kôry o hmotnosti približne 1 g v mrazenom stave z tylo­vého, čelného, spánkového a temenného laloku, ako aj z hipokampu (iba 0,3 g), od 5 jedincov s po­ruchou autistického spektra, potvrdenou pomocou ADI-R (= Autism Diagnostic Interview — Revi­sed = rozhovor na diagnostiku autizmu — revidovaný), z toho 4 muži a 1 žena vo veku 15–50 ro­kov, viď Tabuľka č. 1.

    Obsah hliníka v týchto bunkových tkanivách bol zmeraný zavedenou a plne overenou metódou,[13] ktorú tu popíšeme len zbežne. Rozmrazené bunkové tkanivá boli narezané čepeľou z nehrdzavejú­cej ocele, čím sme dostali jednotlivé vzorky o hmotnosti cca 0,3 g (3 vzorky na každý lalok okrem hipokampu, u ktorého sme použili tkanivo tak, ako sme ho dostali) mokrej váhy. Tie sme vysušili na konštantnú hmotnosť pri 37 °C. Vysušené a zvážené tkanivá boli rozložené v mikrovlnke (MARS Xpress CEM Microwave Technology Ltd.) v zmesi 1 ml 15,8M HNO3 (Fisher Analytical Grade) a 1 ml 30% (hmotnosť/objem) H2O2 (BDH Aristar). Výsledné roztoky boli číre, bez mastných zvyš­kov, a po ochladení boli doplnené do 5 ml ultra-čistou vodou (vodivosť < 0,067 μS/cm). Celkový obsah hliníka bol v každej vzorke zmeraný atómovou absorpčnou spektrometriou s priečne vyhrie­vanou grafitovou pieckou (angl. Transversely Heated Graphite Furnace Atomic Absorption Spectro­metry = TH GFAAS) pomocou matricových kalibračných štandardov a zavedeného analytického programu, spolu s vopred overenými údajmi o zabezpečení kvality.[13]

 

2.2. Fluorescenčná mikroskopia

    Všetky chemikálie boli od firmy Sigma Aldrich (Spojené kráľovstvo), ak nie je uvedené inak. Ak to bolo možné, bunkové tkanivá z tylového, čelného, spánkového a temenného laloku, ako aj z hi­pokampu od 10 darcov (3 žien a 7 mužov) s diagnózou ASD sme získali od Oxfordskej mozgovej banky ako tri 5 μm hrubé, sériové, parafínom zaliate rezy z každého laloku od každého darcu (viď Tabuľka č. 2). Tkanivové rezy, pripevnené na sklíčka, boli umiestnené do stojanu na sklíčka, násled­ne odvoskované a rehydratované pomocou prechodu skrz 250 ml nasledovných reagentov: 3 minúty v Histo-Clear (National Diagnostics, USA), 1 minútu v čerstvom Histo-Clear, 2 minúty v 100% eta­nole (HPLC kvalita) a 1 minútu v 90%, 70%, 50% a 30% (objem/objem) etanole. Nasledovala re­hydratácia v ultra-čistej vode (vodivosť < 0,067 μS/cm) počas 35 sekúnd. Sklíčka boli v každom re­agente každých 20 sekúnd potrasené a počas prenosu medzi jednotlivými rozpúšťadlami osušené hygienickým papierom, aby sa minimalizoval prenos rozpúšťadla z jednej nádoby do druhej. Re­hydrované rezy mozgového bunkového tkaniva boli pred farbením starostlivo ohraničené PAP pe­rom, aby sa vytvorila hydrofóbna (vodu odpudzujúca) prekážka (bariéra) okolo okrajov tkanivo­vých rezov. Pomedzi farbenia boli tkanivové rezy hydratované v ultra-čistej vode a uchovávané vo zvlhčovacej komore, aby sa predišlo ich vyschnutiu.

    Farbenie bolo rozvrhnuté tak, aby sa umožnili presné inkubačné časy tkanivových rezov mozgu. Vyvinuli a optimalizovali sme fluór-lumogallion ako selektívne farbivo na hliník v bunkách[14] a ľud­ských bunkových tkanivách.[15] Lumogallion (4-chlóro-3-(2,4-di-hydroxy-fenyl-azo)-2-hydroxyben­zén-1-sulfónová kyselina, TCI Europe N.V., Belgicko) bol pripravený na cca 1 mM skrz riedenie v 50 mM PIPES (1,4-piperazín-di-etán-sulfónová kyselina) pufri, upravenom na pH 7,4 pomocou NaOH. Lumogallionové farbenie bolo vykonané pridaním 200 μl farbiaceho roztoku do rehydrato­vaných rezov mozgového bunkového tkaniva, ktoré boli následne 45 minút inkubované pri teplote okolitého vzduchu v tme. Rezy pre autofluorescenčné analýzy boli inkubované 45 minút v 200 μl samotného 50 mM PIPES pufra s pH 7,4. Po farbení boli sklíčka s tkanivovými rezmi 6× premyté 200 μl čiastkami 50 mM PIPES pufra s pH 7,4. Následne boli oplachované 30 sekúnd v ultra-čistej vode. Sériové rezy, očíslované 1 a 2, z každého laloku boli inkubované v 50 mM PIPES pufra s pH 7,4 alebo zafarbené 1 mM lumogallionom v tom istom pufri, aby bola zachovaná konzistentnosť medzi tkanivami daného darcu. Všetky tkanivové rezy boli následne pripevnené pod sklené krycie sklíčka pomocou vodnatého pripevňovacieho prostriedku Fluoromount™. Sklíčka boli uložené vo­dorovne v tme na 24 hodín pri teplote 4 °C a až potom boli analyzované fluorescenčnou mikrosko­piou.

    Zafarbené a upevnené tkanivové rezy z ľudských mozgov boli analyzované pomocou fluorescen­čného mikroskopu Olympus BX50, vybaveného vertikálnym osvetľovačom a nástavcom BX-FLA na fluorescenciu odrazeného svetla (zdroj ortuti). Mikrofotografie sme získali pri 400-násobnom zväčšení pomocou objektívu X 40 Plan-Fluorite (Olympus, Spojené kráľovstvo). Autofluorescenčné mikrofotografie na lumogallion reaktívneho hliníka sme získali pomocou fluorescenciu filtrujúcej kocky U-MNIB3 (excitácia: 470–495 nm, dichromatické zrkadlo: 505 nm, emisia dlhších vlnových dĺžok (longpass): 510 nm, Olympus, Spojené kráľovstvo). Hodnoty svetelnej expozície a prenosu boli pevné pre príslušné zafarbenie a obrázky sme získali pomocou programu CellD (Olympus, Soft Imaging Solutions, SiS, GmbH). Na lumogallion reagujúce oblasti, zistené skrz postupné skúmanie zafarbených tkanivových rezov, boli dodatočne zobrazené na autofluorescenčných sériových re­zoch, aby sa vyhodnotilo prispenie fluorofóru. Následné spojenie fluorescenčného kanálu s kanálom s jasným podsvietením (bright-field) sme dosiahli pomocou programu Photoshop (Adobe Systems Inc., USA). Pri zisťovaní vnútrobunkového zafarbenia sme typ zafarbených buniek odhadovali po­dľa ich veľkosti a tvaru v kontexte danej oblasti mozgu a ich okolitého bunkového prostredia.

 

3. Výsledky

3.1. Obsah hliníka v bunkových tkanivách z mozgu

    Obsah hliníka vo všetkých skúmaných tkanivách sa pohyboval od 0,01 (najmenšie použitou technológiou zistiteľné množstvo) až do 22,11 μg/g suchej hmotnosti (viď Tabuľka č. 1). Obsah hliníka v celých mozgoch (n = 4 resp. 5 podľa dostupnosti tkaniva hipokampu) bol v rozmedzí od 1,2 (1,06) μg/g suchej hmotnosti u 44-ročnej ženy (A1) po 4,77 (4,79) μg/g suchej hmotnosti u 33-ročného muža (A5). Predchádzajúce merania hliníka v mozgu, vrátane našej štúdie 60 mozgov,[13] nám umožnili definovať približné kategórie obsahu hliníka v mozgu, počnúc ≤ 1,00 μg/g suchej hmotnosti ako patologicky benígny (čo nie je to isté ako „normálny). Približne 40% bunkových tkanív (24 z 59) malo obsah hliníka, považovaný za patologicky znepokojivý (≥ 2,00 μg/g suchej hmotnosti), zatiaľčo približne 67% z nich malo obsah hliníka, považovaný za patologicky význam­ný (≥ 3,00 μg/g suchej hmotnosti). Mozgy všetkých 5 jedincov, skúmaných v aktuálnej štúdii, mali aspoň jedno tkanivo s patologicky významným množstvom hliníka. Mozgy 4 jedincov mali aspoň 1 tkanivo s obsahom hliníka ≥ 5,00 μg/g suchej hmotnosti, pričom 3 z nich mali aspoň 1 tkanivo s ob­sahom hliníka ≥ 10,00 μg/g suchej hmotnosti (viď Tabuľka č. 1). Priemery (štatistické odchýlky) obsahu hliníka boli 3,82 (5,42), 2,30 (2,00), 2,79 (4,05) a 3,82 (5,17) μg/g suchej hmotnosti pre ty­lový, čelný, spánkový resp. temenný lalok. Medzi týmito 4 lalokmi neboli žiadne štatisticky vý­znamné rozdiely v obsahu hliníka.

 

Tabuľka č. 1

    Obsah hliníka v bunkovom tkanive z tylového (O), čelného (F), spánkového (T) a temenného (P) laloku a hipokampu (H) z mozgov 5 darcov s diagnózou ASD:

Kód darcu Pohlavie Vek Lalok Rez č. Obsah hliníka v μg/g
A1 Ž 44 O 1 0,49
        2 4,26
        3 0,33
        priemer (štat. odchýlka) 1,69 (2,22)
      F 1 0,98
        2 1,10
        3 0,95
        priemer (štat. odchýlka) 1,01 (0,08)
      T 1 1,13
        2 1,16
        3 1,12
        priemer (štat. odchýlka) 1,14 (0,02)
      P 1 0,54
        2 1,18
        3
        priemer (štat. odchýlka) 0,86 (0,45)
      všetky priemer (štat. odchýlka) 1,20 (1,06)
 
A2 M 50 O 1 3,73
        2 7,87
        3 3,49
        priemer (štat. odchýlka) 5,03 (2,46)
      F 1 0,86
        2 0,88
        3 1,65
        priemer (štat. odchýlka) 1,13 (0,45)
      T 1 1,31
        2 1,02
        3 2,73
        priemer (štat. odchýlka) 1,69 (0,92)
      P 1 18,57
        2 0,01
        3 0,64
        priemer (štat. odchýlka) 6,41 (10,54)
      H 1 1,42
      všetky priemer (štat. odchýlka) 3,40 (5,00)
 
A3 M 22 O 1 0,64
        2 2,01
        3 0,66
        priemer (štat. odchýlka) 1,10 (0,79)
      F 1 1,72
        2 4,14
        3 2,73
        priemer (štat. odchýlka) 2,86 (1,22)
      T 1 1,62
        2 4,25
        3 2,57
        priemer (štat. odchýlka) 2,81 (1,33)
      P 1 0,13
        2 3,12
        3 5,18
        priemer (štat. odchýlka) 2,82 (1,81)
      všetky priemer (štat. odchýlka) 2,40 (1,58)
 
A4 M 15 O 1 2,44
        2 1,66
        3 22,11
        priemer (štat. odchýlka) 8,74 (11,59)
      F 1 1,11
        2 3,23
        3 1,66
        priemer (štat. odchýlka) 2,00 (1,10)
      T 1 1,10
        2 1,83
        3 1,54
        priemer (štat. odchýlka) 1,49 (0,37)
      P 1 1,38
        2 6,71
        3
        priemer (štat. odchýlka) 4,05 (3,77)
      H 1 0,02
      všetky priemer (štat. odchýlka) 3,73 (6,02)
 
A5 M 33 O 1 3,13
        2 2,78
        3 1,71
        priemer (štat. odchýlka) 2,54 (0,74)
      F 1 2,97
        2 8,27
        3
        priemer (štat. odchýlka) 5,62 (3,75)
      T 1 1,71
        2 1,64
        3 17,10
        priemer (štat. odchýlka) 6,82 (8,91)
      P 1 5,53
        2 2,89
        3
        priemer (štat. odchýlka) 4,21 (1,87)
      všetky priemer (štat. odchýlka) 4,77 (4,79)

 

3.2. Fluorescencia hliníka v bunkových tkanivách z mozgu

    Preskúmali sme sériové rezy mozgov 10 jedincov (3 žien a 7 mužov), ktorí zomreli s diagnózou ASD a zaznamenali sme prítomnosť hliníka v týchto tkanivách (viď Tabuľka č. 2). Excitácia kom­plexu hliníka s lumogallionom emituje charakteristickú oranžovú fluorescenciu, ktorá sa javí ako čoraz viac svetlo-žltá pri vyšších intenzitách fluorescencie. Hliník, rozpoznaný ako na lumogallion reaktívne depozity, bol zaznamenaný v aspoň jednom tkanive u všetkých 10 jedincov. Autofluo­rescencia susedných sériových rezov potvrdila lumogallionovú fluorescenciu ako indikátor hliníka. Depozity hliníka boli výrazne viac prítomné u mužov (129 u 7 jedincov) než u žien (21 u 3 jedin­cov). Hliník bol zistený ako v bielej hmote (62 depozitov), tak aj v šedej hmote (88 depozitov). U žien bola väčšina zistených hliníkových depozitov umiestnená mimo buniek (15 z 21), zatiaľčo u mužov to bolo opačne — 80 zo 129 depozitov bolo vnútri buniek. Boli nám dodané len 3 sériové rezy z každého tkaniva, takže sme neboli schopní vykonať farbenie na zistenie všeobecnej morfoló­gie, čo znamená, že nebolo vždy možné zistiť, ktorý podtyp bunky vykazoval hliníkovú fluorescen­ciu.

 

Tabuľka č. 2

    Súhrnná tabuľka s podrobnosťami o celkovom počte na lumogallion reaktívnych depozitov, zis­tených v bunkovom tkanive mozgov 10 darcov s diagnózou autizmus z Oxfordskej mozgovej banky (Oxford Brain Bank), Spojené kráľovstvo. Celkový (Σ) počet vnútrobunkových (V) a mimobunko­vých (M) na lumogallion reaktívnych hliníkových depozitov, pozorovaný v bielej (B) a šedej (Š) hmote mužských (M) a ženských (Ž) darcov.

Autistický darca Časť mozgu
Kód Vek Pohl
avie
Čelný lalok Temenný l. Tylový lalok Spánkový l. Hipokampus
B Š B Š B Š B Š B Š
A1 44 Ž V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 2
Σ: 2
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 0
M: 3
Σ: 3
V: 1
M: 2
Σ: 3
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 3
Σ: 3
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
A6 29 Ž V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 1
Σ: 1
A7 13 Ž V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 1
M: 3
Σ: 4
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0

Ženy spolu

V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 1
M: 2
Σ: 3
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 1
M: 6
Σ: 7
V: 1
M: 2
Σ: 3
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 3
Σ: 3
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 1
Σ: 1
A2 50 M V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 6
M: 0
Σ: 6
V: 0
M: 2
Σ: 2
V: 5
M: 5
Σ: 10
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 4
Σ: 4
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 3
Σ: 3
V: 7
M: 0
Σ: 7
V: 1
M: 2
Σ: 3
A5 33 M V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
A8 29 M V: 2
M: 1
Σ: 3
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 4
M: 0
Σ: 4
V: 3
M: 1
Σ: 4
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 0
Σ: 0
A9 22 M V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 1
M: 0
Σ: 1
A3 22 M V: 1
M: 2
Σ: 3
V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 3
M: 2
Σ: 5
V: 2
M: 1
Σ: 3
V: 1
M: 1
Σ: 2
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 2
M: 3
Σ: 5
V: 3
M: 1
Σ: 4
A4 15 M V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 1
M: 2
Σ: 3
V: 2
M: 0
Σ: 2
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 3
M: 0
Σ: 3
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 4
M: 0
Σ: 4
V: 3
M: 0
Σ: 3
V: 0
M: 0
Σ: 0
A10 14 M V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 1
M: 0
Σ: 1
V: 0
M: 1
Σ: 1
V: 0
M: 2
Σ: 2
V: 6
M: 1
Σ: 7
V: 0
M: 0
Σ: 0
V: 1
M: 1
Σ: 2

Muži spolu

V: 6
M: 3
Σ: 9
V: 11
M: 0
Σ: 11
V: 8
M: 6
Σ: 14
V: 15
M: 7
Σ: 22
V: 4
M: 3
Σ: 7
V: 6
M: 5
Σ: 11
V: 0
M: 3
Σ: 3
V: 10
M: 5
Σ: 15
V: 14
M: 3
Σ: 17
V: 6
M: 4
Σ: 10

    Hliníkom naplnené jedno-jadrové (mononukleárne) biele krvinky, pravdepodobne lymfocyty, bo­li zistené v mozgových blanách, možno počas vstupu do mozgového tkaniva z lymfatickej sústavy (viď Obrázok č. 1). Hliník jasne vidno vnútri buniek ako buď jednotlivé bodové depozity alebo ako svetlo-žltú fluorescenciu. Hliník bol zistený v zápalových bunkách v cievach (viď Obrázok č. 2). Našli sme niečo, čo vyzerá ako hliníkom naplnený lymfocyt či monocyt, vnútri dutiny cievy, obklo­pené červenými krvinkami, zatiaľčo iný zrejme lymfocyt s intenzívne žltou fluorescenciou sme na­šli v cievnej stene (viď Obrázok č. 2b). Gliové bunky (vrátane mikrogliám podobných buniek), kto­ré vykazovali hliníkovú fluorescenciu, sme často pozorovali v mozgovom tkanive v blízkosti hliní­kom zafarbených mimobunkových depozitov (viď Obrázok č. 3 a Obrázok č. 4). Menšie depozity hliníka o priemere približne 1 μm boli jasne viditeľné ako v okrúhlych, tak aj améboidných gliových bunkách (viď napr. Obrázok č. 3b). Vnútrobunkový hliník bol zistený v (pravdepodobne) neurónoch a gliám podobných bunkách, často v prítomnosti lipofuscínu (viď Obrázok č. 5). Hliník zvýrazňujúca fluorescencia úspešne zistila hliník mimo buniek i vnútri buniek (v neurónoch i ne­neurónových bunkách) a vo všetkých skúmaných bunkových tkanivách z mozgu (viď Obrázok č. 1, Obrázok č. 2, Obrázok č. 3, Obrázok č. 4Obrázok č. 5). Táto metóda zisťuje iba hliník, ako sa to ukazuje na veľkých oblastiach mozgového tkaniva bez akejkoľvek charakteristickej hliníkovej fluorescencie (viď Obrázok č. 6).

 

Obrázok č. 1

Obrázok č. 1
Jednojadrové zápalové bunky (asi lymfocyty) v membránach mozgových blán v hipokampe a čelnom laloku 50-ročného muža (A2) s diagnózou autizmus. Vnútrobunkový, na lumogallion reaktívny hliník vidno ako bodové oran­žové fluorescenčné žiarenie (biele šípky) v hipokampe (a) a čelnom laloku (b). Zelené autofluorescenčné žiarenie bolo zistené v priľahlom nefarbenom (5 μm) sériovom reze (c + d). Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samotného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

Obrázok č. 2

Obrázok č. 2
Vnútrobunkový, na lumogallion reaktívny hliník v cievach hipokampu 50-ročného muža (A2) s diagnózou autiz­mus. Hliníkom naplnené zápalové bunky, zistené v stene cievy v hipokampe (biela šípka) (a) a znázornené ako bo­dová oranžová fluorescencia v dutine cievy (b) sú zvýraznené. Jedna zápalová bunka vo vonkajšej vrstve cievnej steny je označená bielou šípkou (b). Na lumogallion reaktívny hliník sme zistili skrz oranžové fluorescenčné vyža­rovanie (a + b), ako aj cez zelené autofluorescenčné vyžarovanie (c + d) susedného nefarbeného (5 μm) sériového rezu. Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samotného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

Obrázok č. 3

Obrázok č. 3
Vnútrobunkový hliník v bunkách, morfologicky (tvarovo) kompatibilných s gliami a neurónmi v hipokampe 15-roč­ného chlapca (A4) s diagnózou autizmus. Zvýraznený (biele šípky) je na lumogallion reaktívny hliník, zistený vnú­tri gliovitých buniek v hipokampe (a) a vytvárajúci bodovitú oranžovú fluorescenciu v gliách, obklopujúcich prav­depodobne neurónovú bunku v rámci temenného laloku (b). Na lumogallion reaktívny hliník sme zistili skrz oran­žové fluorescenčné vyžarovanie (a + b), ako aj cez zelené autofluorescenčné vyžarovanie (c + d) susedného nefar­beného (5 μm) sériového rezu. Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samotného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

Obrázok č. 4

Obrázok č. 4
Vnútrobunkový hliník v bunkách, morfologicky (tvarovo) kompatibilných s mikrogliami v rámci temenného a spán­kového laloku 29-ročného muža (A8) a 15-ročného chlapca (A4), obaja s diagnózou autizmus. Na lumogallion re­aktívny mimobunkový hliník (biele šípky), vydávajúci oranžové fluorescenčné žiarenie, bol zistený okolo zrejme mikrogliových buniek v temennom laloku darcu A8 (a) resp. spánkovom laloku darcu A4 (b). Nefarbené susedné (5 μm) sériové rezy vydávali len slabé zelené autofluorescenčné žiarenie v totožnej oblasti bielej (c) resp. šedej (d) hmoty príslušných lalokov. Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samot­ného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

Obrázok č. 5

Obrázok č. 5
Na lumogallion reaktívny hliník v pravdepodobne neurónových a gliových bunkách spánkového laloku a hipokam­pu 14-ročného chlapca (A10) s diagnózou autizmus. Vnútro-neurónový hliník v spánkovom laloku (a) bol zistený podľa oranžového fluorescenčného žiarenia vedľa lipofuscínu, ktorý odhaľuje žltá fluorescencia v nefarbenom su­sednom (5 μm) autofluorescenčnom sériovom reze (c). Vnútrobunková bodovitá oranžová fluorescencia (biela šíp­ka) bola zistená v gliách hipokampu (b), vytvárajúc zelené autofluorescenčné žiarenie na nefarbenom reze (d). Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samot­ného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

Obrázok č. 6

Obrázok č. 6
Ukážkové negatívne lumogallionové zafarbenie šedej a bielej hmoty čelného laloku 14-ročného chlapca (A10) s diagnózou autizmus. Lumogallionové zafarbenie, ktoré neukázalo prítomnosť hliníka, vytvorilo slabé hnedé až žlté fluorescenčné žiarenie v šedej hmote (a) so zvýšenou intenzitou typicky v oblastiach bielej hmoty (b). Slabé ze­lené autofluorescenčné žiarenie nefarbených susedných (5 μm) sériových rezov (c + d) ukázalo depozity lipofuscí­nu, ktoré vytvárajú žlté fluorescenčné žiarenie. Horné a dolné bočné panely znázorňujú hviezdičkami označené zväčšené výrezy fluorescenčného kanála samotného a prekrytého snímkou s jasným podsvietením (bright field). Zväčšenie: 400×. Skutočná dĺžka bielej čiary (mierka): 50 μm.

 

4. Diskusia

    Obsah hliníka v bunkových tkanivách z mozgov darcov s diagnózou ASD bol extrémne vysoký (viď Tabuľka č. 1). Hoci boli významné rozdiely medzi jednotlivými tkanivami, lalokmi a jedinca­mi, priemer obsahu hliníka v každom laloku u všetkých 5 jedincov bol okolo hornej hranice všet­kých predchádzajúcich (historických) meraní obsahu hliníka v mozgu, vrátane iatrogénnych chorôb, ako je dialyzačná encefalopatia (demencia).[13][15][16][17][18][19] Všetci 4 mužskí darcovia mali významne vyššie koncentrácie hliníka v mozgu než jediná ženská darkyňa. Zaznamenali sme jedny z najvyš­ších hodnôt obsahu hliníka v mozgu, aké kedy boli namerané, v bunkových tkanivách týchto muž­ských darcov s ASD, vrátane hodnôt 17,10, 18,57 a 22,11 μg/g suchej hmotnosti (viď Tabuľk a č. 1). To, čím sa tieto údaje odlišujú od iných analýz hliníka v mozgu u iných chorôb, je vek autistických darcov. Prečo by napr. 15-ročný chlapec mal mať tak vysoký obsah hliníka v mozgu? Vo vedeckej literatúre nie sú žiadne porovnateľné údaje. Najbližšie k tomu je obsah hliníka v mozgu 42-ročného muža s dedičnou Alzheimerovou chorobou.[19]

    Hliník zvýrazňujúca fluorescenčná mikroskopia poskytla údaje o umiestnení hliníka v týchto tka­nivách z mozgu autistov (viď Obrázok č. 1, Obrázok č. 2, Obrázok č. 3, Obrázok č. 4Obrázok č. 5). Hliník sme našli v bielej i v šedej hmote a ako mimo buniek, tak aj (a hlavne) vnútri buniek. Bunky, podľa morfológie neneurónové, s vysokým obsahom hliníka sme našli v mozgových bla­nách (viď Obrázok č. 1), cievach (viď Obrázok č. 2) a v šedej i bielej hmote (viď Obrázok č. 1, Obrázok č. 2 a Obráz ok č. 3). Niektoré z týchto buniek sa javili byť gliové (pravdepodobne astrocy­tické), zatiaľčo iné mali podlhovasté jadro, takže vyzerali ako mikroglie.[5] Tie druhé bolo niekedy vidno v blízkosti mimobunkových depozitov hliníka. Z toho vyplýva, že hliník sa nejak dostal cez krvno-mozgovú prekážku (hemato-encefalickú bariéru) a bol pohltený miestnymi bunkami, meno­vite mikrogliami. Zaujímavé je, že občasná prítomnosť hliníkom naložených zápalových buniek v cievach a v mozgových blanách otvára inú vstupnú bránu hliníka do mozgu, t.j. vnútri buniek. Na to, aby nastal tento druhý scenár vo významnejšom meradle, by sme však očakávali nejaké zranenie vnútri mozgu, ktoré by dovolilo lymfocytom a monocytom vyrojiť sa z ciev.[20] Toto rozpoznanie ne­neurónových buniek (vrátane zápalových buniek, gliových buniek a mikroglií), naplnených hliní­kom, je prelomovým objavom charakteristiky ASD. Napr. väčšina depozitov hliníka, zistených v mozgoch pacientov s dedičnou Alzheimerovou chorobou, bola mimo buniek, a to takmer vždy v šedej hmote.[19] Hliník je cytotoxický (jedovatý pre bunky)[21] a jeho prítomnosť v zápalových bun­kách v cievach, mozgových blanách a centrálnej nervovej sústave bude sotva benígna (neškodná). Mikroglie s veľkou náložou hliníka, hoci možno zostanú nažive (prinajmenšom nejaký čas), budú nevyhnutne poškodené a predpokladá sa, že dysfunkčné mikroglie majú do činenia so vznikom ASD,[22] napr. tým, že narušia prerezávanie synapsií.[23] Navyše vyššie vyslovená hypotéza, že u ASD vstupuje hliník do mozgu vnútri imunitných buniek, kolujúcich v krvi a lymfe, by mohla odpovedať na vyššie položenú otázku, že prečo je tak veľa hliníka v mozgu 15-ročného chlapca s ASD.

    Obmedzením našej štúdie je malý počet prípadov, ktoré sme mohli skúmať, a obmedzená do­stupnosť bunkových tkanív. Mať prístup len k 1 g zmrazeného tkaniva a iba k 3 sériovým rezom tkaniva na jeden lalok by sa normálne vnímalo ako značné obmedzenie. Istotne, ak by sme nezistili žiadne významné depozity hliníka v tak malej vzorke (priemerný mozog váži medzi 1,5 a 2 kg) tka­niva z mozgu, tak by také zistenie bolo nejednoznačné. Avšak skutočnosť, že sme našli hliník v kaž­dej vzorke bunkového tkaniva z mozgu, zmrazeného alebo fixovaného, veľmi silne naznačuje, že jedinci s diagnózou ASD majú mimoriadne vysoké hladiny hliníka v bunkových tkanivách svojich mozgov a že tento hliník je umiestnený predovšetkým vnútri neneurónových buniek, vrátane mikro­glií a ďalších zápalových monocytov.

 

5. Závery

    Vykonali sme prvé merania hliníka v mozgovom bunkovom tkanive pacientov s ASD a preuká­zali sme, že obsah hliníka v ich mozgoch je mimoriadne vysoký. Zistili sme hliník v mozgu mimo buniek i vnútri buniek, a to ako neurónov, tak aj neneurónových buniek. Prítomnosť hliníka v zápa­lových bunkách v mozgových blanách, cievach, šedej a bielej hmote je prelomovým objavom a mô­že preukázať účasť hliníka na etiológii (mechanizme vzniku) ASD.

 

Konflikty záujmov

    Autori prehlasujú, že nemajú žiadne konflikty záujmov.

 

Čím prispel ktorý autor

    CE navrhol túto štúdiu, spracúval bunkové tkanivá a vykonával TH GFAAS. DU spracúvala bunkové tkanivá a vykonávala TH GFAAS. AK skúmal neuropatológiu mozgu na rezoch, priprave­ných MM. MM vykonal všetku mikroskopiu a spolu s CE napísal rukopis článku. Všetci autori si prečítali a schválili tento rukopis.

 

Poďakovanie

    Tento výskum bol podporený grantom z Children’s Medical Safety Research Institute (CMSRI), neziskovou nadáciou, podporujúcou výskum, z Washingtonu DC, USA.

 

Poznámky pod čiarou a zdroje:

[a]  The Birchall Centre, Lennard-Jones Laboratories, Keele University, Staffordshire, ST5 5BG, United Kingdom

[b]  Life Sciences, Keele University, Staffordshire, ST5 5BG, United Kingdom

[c]  Department of Clinical Neuropathology, Kings College Hospital, London, SE5 9RS, United Kingdom

[1]  Krishnan A, Zhang R, Yao V, Theesfeld CL, Wong AK, Tadych A, Volfovsky N, Packer A, Lash A, Troyanskaya OG: Genome-wide prediction and functional characterization of the genetic basis of autism spectrum disorder, Nat Neurosci, 2016, 19(11):1454–1462

[2]  Sealey LA, Hughes BW, Sriskanda AN, Guest JR, Gibson AD, Johnson-Williams L, Pace DG, Bagasra O: Environmental factors in the development of autism spectrum disorders, Environ Int, 2016, 88:288–298

[3]  Koyama R, Ikegaya Y: Microglia in the pathogenesis of autism spectrum disorders, Neurosci Res, 2015, 100:1–5

[4]  Li Q, Zhou JM: The microbiota-gut-brain axis and its potential therapeutic role in autism spectrum disorder, Neuroscience, 2016, 324:131–139

[5]  Kaur C, Rathnasamy G, Ling EA: Biology of Microglia in the Developing Brain, J Neuropathol Exp Neurol, 2017, 76(9):736–753

[6]  Varghese M, Keshav N, Jacot-Descombes S, Warda T, Wicinski B, Dickstein DL, Harony-Nicolas H, De Rubeis S, Drapeau E, Buxbaum JD, Hof PR: Autism spectrum disorder: neuropathology and animal models, Acta Neuro­pathol, 2017, 134(4):537–566

[7]  Yasuda H, Yasuda Y, Tsutsui T: Estimation of autistic children by metallomics analysis, Sci Rep, 2013, 3:1199

[8]  Mohamed FEB, Zaky EA, El-Sayed AB, Elhossieny RM, Zahra SS, Salah Eldin W, Youssef WY, Khaled RA, Youssef AM: Assessment of Hair Aluminum, Lead, and Mercury in a Sample of Autistic Egyptian Children: Environmental Risk Factors of Heavy Metals in Autism, Behav Neurol, 2015, 2015:545674

[9]  Rahbar MH, Samms-Vaughan M, Pitcher MR, Bressler J, Hessabi M, Loveland KA, Christian MA, Grove ML, Shakespeare-Pellington S, Beecher C, McLaughlin W, Boerwinkle E: Role of Metabolic Genes in Blood Alumi­num Concentrations of Jamaican Children with and without Autism Spectrum Disorder, Int J Environ Res Public Health, 2016, 13(11):E1095

[10]  Skalny AV, Simashkova NV, Klyushnik TP, Grabeklis AR, Radysh IV, Skalnaya MG, Tinkov AA: Analysis of Hair Trace Elements in Children with Autism Spectrum Disorders and Communication Disorders, Biol Trace Elem Res, 2017, 177(2):215–223

[11]  Tomljenovic L, Shaw CA: Do aluminum vaccine adjuvants contribute to the rising prevalence of autism?, J Inorg Biochem, 2011, 105(11):1489–1499, po slovensky tu: http://www.slobodavockovani.sk/news/studia-prispivaji-hlinikova-adjuvans-ve-vakcinach-k-stoupajicimu-vyskytu-autismu/

[12]  Shaw CA, Li Y, Tomljenovic L: Administration of aluminium to neonatal mice in vaccine-relevant amounts is associated with adverse long term neurological outcomes, J Inorg Biochem, 2013, 128:237–244

[13]  House E, Esiri M, Forster G, Ince PG, Exley C: Aluminium, iron and copper in human brain tissues donated to the Medical Research Council's Cognitive Function and Ageing Study, Metallomics, 2012, 4(1):56–65

[14]  Mold M, Eriksson H, Siesjö P, Darabi A, Shardlow E, Exley C: Unequivocal identification of intracellular aluminium adjuvant in a monocytic THP-1 cell line, Sci Rep, 2014, 4:6287

[15]  Mirza A, King A, Troakes C, Exley C: The Identification of Aluminum in Human Brain Tissue Using Lumogallion and Fluorescence Microscopy, J Alzheimers Dis, 2016, 54(4):1333–1338

[16]  Exley C, Esiri MM: Severe cerebral congophilic angiopathy coincident with increased brain aluminium in a resident of Camelford, Cornwall, UK, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2006, 77(7):877–879

[17]  Exley C, House ER: Aluminium in the human brain, Monatsh Chem, 2011, 142(4):357–363

[18]  Exley C, Vickers T: Elevated brain aluminium and early onset Alzheimer's disease in an individual occupationally exposed to aluminium: a case report, J Med Case Rep, 2014, 8:41

[19]  Mirza A, King A, Troakes C, Exley C: Aluminium in brain tissue in familial Alzheimer's disease, J Trace Elem Med Biol. 2017 Mar;40:30-36

[20]  Shechter R, Miller O, Yovel G, Rosenzweig N, London A, Ruckh J, Kim KW, Klein E, Kalchenko V, Bendel P, Lira SA, Jung S, Schwartz M: Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus, Immunity, 2013, 38(3):555–569

[21]  Exley C: The toxicity of aluminium in humans, Morphologie, 2016, 100(329):51–55

[22]  Salter MW, Stevens B: Microglia emerge as central players in brain disease, Nat Med, 2017, 23(9):1018–1027

[23]  Neniskyte U, Gross CT: Errant gardeners: glial-cell-dependent synaptic pruning and neurodevelopmental disorders, Nat Rev Neurosci. 2017 Nov;18(11):658-670

 

Kontakt

Ing. Marián FILLO Jaseňová 26
01007 ŽILINA
tel./SMS/MMS: 0904 827 031

číslo účtu SK:
520700-4200920643/8360
SK1983605207004200920643
BIC/SWIFT: BREXSKBX

číslo účtu CZ:
2800070065/2010
sloboda.v.ockovani@gmail.com